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Oxford Nanopore · 三代测序

全长转录组测序 ONT-lrRNA-seq

短读长测序是把转录本打碎成 150 bp 的片段再拼回去，同一个基因的几条 isoform 共享大部分外显子，碎片归属只能靠推测。ONT-lrRNA-seq 反过来做：不打断、不拼接，一条 read 从 5′ 端一路读到 3′ 端，全长转录本直接测出来， isoform 的种类和各自的表达量都是实测值，不是推出来的。

  • 不打断不拼接
  • 全长 isoform
  • 可变剪接 / APA
  • 新转录本与融合基因
  • 组织 / 细胞 / 全血 / 植物
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全长读长一条 read 覆盖完整转录本，无需组装
≥2µg RNARNA 起送量；动物组织 ≥20 mg 起
RIN≥7.0RNA 完整性门槛，OD260/280 ≥1.8
4类分析DEG / DET / DTU + 可变剪接 + APA
01

技术简介

基因先转录成前体 RNA，再经过可变剪接（同一个基因把外显子按不同方式拼接）形成不同的成熟转录本，最后翻译成结构和功能都可能不同的蛋白质 isoform。 isoform 不是生物学上的小众现象——人类基因组中超过 90% 的基因都存在可变剪接，很多 isoform 只在特定疾病、组织或发育阶段出现。

问题出在怎么测它。短读长 cDNA 测序读的是 150 bp 左右的片段，这些片段大多落在几条 isoform 共有的外显子上，单看片段无法判断它来自哪一条。跨剪接位点的读段能补一部分信息，但遇到几条 isoform 共用同一个剪接位点时仍然分不开。

ONT-lrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies long-read RNA sequencing）绕开了这一步：直接检测全长 isoform，一条 read 就对应一个完整的 RNA 分子。这样既不用组装、也不用给共享外显子做归属推断， isoform 层面的定量是实测出来的，差异表达转录本分析的准确性随之提高。

同一基因经可变剪接产生多种全长转录本 isoform 的示意，对比短读长片段无法判断来源
同一基因的多种 isoform：短读长片段落在共有外显子上，无法判断归属；长读长一次读完
02

技术优势

完善基因注释

发现新的转录本和基因，拿到的是这一份样本里真实存在的转录本清单，而不是参考注释里预先写好的那一份。对非模式物种尤其明显——很多基因本来就没有注释。

三个层面的差异分析

差异表达基因（DEG）、差异表达转录本（DET）、差异使用转录本（DTU）。前两个看"量变了多少"，DTU 看的是同一个基因里几条 isoform 的比例有没有换过——基因总表达量不变、但 isoform 比例变了的情况，只有 DTU 能抓到。

基因结构分析

准确分析可变剪接（AS）、多聚腺苷酸化位点（APA）和 3′UTR 长度。APA 换一个位点，3′UTR 长度就跟着变，而 3′UTR 是 miRNA 和 RNA 结合蛋白的主要作用区域，长度变化会直接影响 mRNA 的稳定性和翻译效率。

转录本分辨率

在转录本水平而不是基因水平上解析调控机制。肿瘤里常见的一类现象是：基因总表达量没变，但 isoform 换了一个，功能完全两样——这类差异在基因水平的定量里会被抹平。

03

技术原理

纳米孔测序的原理是把一根蛋白纳米孔嵌在膜上、两侧加电压，RNA 或 DNA 单链在马达蛋白牵引下穿孔时，不同碱基会引起特征性的电流变化，仪器按电流信号判读碱基序列。它测的是单个分子本身，不需要先合成大量拷贝，也不受"读一段停一下"的限制，所以读长可以拉到整条转录本。

因为是 cDNA 测序路线，本技术测的是逆转录后的双链 cDNA，而不是 RNA 原始分子——这一点和 ONT-DRS 直接 RNA 测序不同：想看 RNA 上的碱基修饰（如 m6A），需要走 DRS 路线。

04

实验流程

1

oligo(dT) 磁珠捕获

用带 oligo(dT) 的磁珠把带 poly(A) 尾的 RNA 抓下来，同时去掉大部分 rRNA

2

逆转录第一链

用"oligo(dT) + 一段固定序列"的引物合成 cDNA 第一链

3

加 TSO 序列

通过链置换把 TSO（模板转换寡核苷酸）序列加到 cDNA 的 3′ 末端

4

PCR 扩增

用引物做 PCR 扩增，形成双链 cDNA

5

末端修平

把双链 cDNA 的两端修平

6

连接接头上机

连接 ONT 测序接头形成测序文库，加载到芯片测序

ONT 全长转录组建库流程：oligo dT 磁珠捕获、逆转录第一链、TSO 链置换添加、PCR 扩增双链 cDNA、末端修平与连接测序接头
ONT-lrRNA-seq 建库流程：捕获 → 逆转录 → 加 TSO → PCR → 修平 → 连接接头
05

送样要求

不建议直接寄送 RNA，能寄组织或细胞更好——RNA 在提取、分装、运输中的降解风险由我方承担更可控。

样本类型ONT-lrRNA-seq说明
RNA 总量≥2 µg如自行提取后送样，请同步提供质检结果
RNA 纯度OD260/280 ≥1.8蛋白或酚残留会压低比值，影响后续酶反应
RNA 完整性RIN ≥7.0特殊物种如没有 28S 条带，可不以 RIN 为准，但 Agilent 2100 图基线要平整
细胞≥1×10⁷ 个TRIzol 充分裂解后 −80 ℃ 保存，干冰运输；勿用胰酶消化
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥50 mg取新鲜组织，块尽量 ≤0.5 cm（绿豆大小）；去除结缔组织与脂肪；预冷 1×PBS 或生理盐水洗去血迹，液氮速冻 1 h 后 −80 ℃ 保存，干冰运输
动物组织 · 肝、脾、胃≥20 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥100 mg
植物组织≥500 mg选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻 20 min 以上，干冰运输
全血4 mL按血液样本常规采血管要求采集与运输
免疫细胞干体积 ≥20 µL一般 10 µL 细胞干体积对应约 1×10⁶ 个细胞
容易踩的三个坑：① 细胞不要连培养基一起冻，冻存时冰晶会刺破细胞，破碎细胞释放的核酸酶会把 RNA 降解掉；② 不要用胰酶消化细胞，胰酶消化膜蛋白同样导致细胞破裂；③ 组织反复冻融会明显拉低 RIN，取样时就分好管，避免取用过程中来回化冻。寄样前可先与技术顾问确认。
06

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 全长序列识别与质控全长 reads 判定、嵌合体过滤、比对到参考基因组
  2. isoform 鉴定与定量转录本组装去冗余、已知 / 新转录本分类、表达量矩阵
  3. 差异表达分析基因水平 DEG、转录本水平 DET、转录本使用比例 DTU
  4. 可变剪接分析七类 AS 事件鉴定与分组间的差异剪接事件
  5. 结构与注释拓展APA 位点、3′UTR 长度、新基因与新转录本注释、ORF 与 lncRNA 预测

高级分析 ADVANCED

  1. 融合基因检测全长 reads 跨两个基因的连接点，直接看到融合伴侣
  2. 功能富集新转录本 / 差异 isoform 的 GO、KEGG、GSEA 富集
  3. 编码潜力与蛋白验证支持ORF 预测、蛋白结构域注释，为后续实验提供候选
  4. 与短读长数据联合长读长定结构、短读长提定量，两套数据互补
  5. 可变剪接与临床关联差异剪接事件的预后关联分析
07

应用案例

案例一
IF 48.5 Nature · 人体组织转录组变异

Transcriptome variation in human tissues revealed by long-read sequencing

长读长测序揭示人体组织的转录组变异

期刊：Nature（IF 48.5）　·　发表时间：2022 年 8 月
样本：88 例 GTEx 组织与细胞系样本　·　测序平台：Oxford Nanopore
阅读原文：doi.org/10.1038/s41586-022-05035-y

研究发现：作者用 ONT 平台为 GTEx 的 88 个组织和细胞系样本建立了长读长 RNA-seq 数据集，作为 GTEx 资源的补充。一共鉴定出 7 万余个新转录本，并对其中约 10% 做了蛋白质表达验证。作者还开发了计算包 LORALS，用来分析罕见变异和常见变异对转录本的影响，刻画了等位基因特异性表达和转录本结构事件；在 PTBP1 敲除实验中观察到转录本结构被明显打乱，说明细胞环境改变会在转录本结构层面体现出来。


案例二
IF 11.2 Genome Medicine · 结直肠癌

Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer

长读长测序揭示结直肠癌中异常可变剪接图谱与新的治疗靶点

期刊：Genome Medicine（IF 11.2）　·　发表时间：2023 年
样本：76 例结直肠癌组织 + 10 例正常组织
阅读原文：doi.org/10.1186/s13073-023-01226-y

研究发现：长读长与短读长结合后共鉴定出 90,703 个转录本，其中超过 62% 是新的；新转录本多为样本特异性、低表达、多外显子，且带癌基因特征。1,472 个差异可变剪接事件与患者预后相关。机制上，TIMP1 的 Δ4-5 亚型在结直肠癌中下调，过表达该亚型能抑制肿瘤生长和转移；剪接因子 SRSF1 负责维持 TIMP1 外显子 4-5 的包含，用 CRISPR/dCasRx 干预可抑制肿瘤生长，使 TIMP1 Δ4-5 成为一个可进一步开发的靶点。


项目案例一
IF 4.1 BMC Cancer · 肝癌消融后复发

Deciphering the mechanisms of transcriptome remodeling in residual HCC recurrence post-radiofrequency ablation via long-read sequencing

长读长测序解析射频消融后肝细胞癌残余复发的转录组重塑机制

期刊：BMC Cancer（IF 4.1，2025 JIF）　·　发表时间：2026 年 8 月
研究团队：新疆医科大学附属肿瘤医院
样本：5 例 HCC 患者射频消融前后的配对肿瘤组织与癌旁组织（消融前肿瘤 / 消融前癌旁 / 消融后残余肿瘤 / 消融后癌旁，共四组）
我司支持：Oxford Nanopore 三代全长转录组测序、生信分析
数据入库：国家基因组科学数据中心 GSA（HRA018858）　·　阅读原文：doi.org/10.1186/s12885-026-16842-1

  • 全长转录组全景：共鉴定 16,975 个基因、47,166 个转录本，其中 16,962 个为新转录本、1,257 个为未注释基因，首次在临床样本层面画出消融前后的全长转录组图谱。
  • isoform 切换：检出 104–232 个显著的转录本使用差异事件（DTU，即同一个基因换用不同版本的转录本）。细胞周期因子 ANAPC13 的 ENST00000514612.5 在残余肿瘤中持续高表达且占比继续升高，DNA 损伤检查点蛋白 RHNO1 的 ENST00000489288.7 同样被肿瘤偏好使用——这类"换版本"是短读长测序看不到的。
  • APA 重塑：选择性多聚腺苷酸化（APA，同一基因在不同位置"收尾"，会改变 3′UTR 长度）图谱被系统性改写，SAE1、RRM2、SPINK1 三个癌基因的 3′UTR 发生 APA 位点切换，可能让它们躲开 miRNA 的转录后监管。

后续价值：CDK1、AURKB、PTTG1、RRM2、UBE2T、BIRC5、SAE1、SPINK1 这 8 个基因在 TCGA-LIHC 队列（50 对配对样本）中全部肿瘤高表达，且高表达均与更差的总生存期显著相关；GSE212604 消融前后配对数据也支持它们在热损伤后持续表达，可作为消融后复发的预警标志物和干预靶点（如 RRM2 抑制剂、SAE1 抑制剂 ML-792）。


项目案例二
IF 5.9 Front Immunol · 强直性脊柱炎

Integrated long-read transcriptomic profiling of peripheral blood from ankylosing spondylitis patients identifies regulatory shifts and core genes associated with programmed cell death

强直性脊柱炎患者外周血的整合长读长转录组分析，识别出与程序性细胞死亡相关的调控转变和核心基因

期刊：Frontiers in Immunology（IF 5.9）2026;17:1640271　·　发表时间：2026 年 3 月
研究团队：河南省人民医院（郑州大学人民医院）风湿免疫科
样本：6 例强直性脊柱炎（AS）患者 + 6 例年龄性别匹配的健康对照，外周血 RNA，每人约 3–4 mL 全血
我司支持：Oxford Nanopore 三代 RNA 测序实验与数据分析（论文致谢与作者单位均已标注）
数据入库：GEO（GSE299639）　·　阅读原文：doi.org/10.3389/fimmu.2026.1640271

  • 12 个样本撑起一张全长图谱：共鉴定 81,940 个转录本、25,343 个基因，其中 1,902 个新转录本、543 个潜在新基因；聚类显示 AS 患者与健康对照在整体表达模式上明显分开。
  • 四个层面同时看：1,088 个差异基因（DEG）、1,812 个差异转录本（DET，1,286 上调 / 526 下调）、50 个发生转录本使用切换的基因（如 LINGO3、SAMD9，整体表达量变化不大但 isoform 比例变了）、304 个差异可变剪接事件（涉及 TLR2、STAT5B、FCGR2B 等免疫相关基因）。DEG 与 DET 交集 508 个基因，含 FAS、FASLG、ULK1 等程序性细胞死亡（PCD）相关基因。
  • 锁定核心基因：整合 DEG、DET、DTU 与剪接四层结果，最终筛出 26 个核心调控基因，其中 NAMPT、GATA2、DDIT3 在多个转录调控层面同时发生变化，是连接免疫失衡与细胞死亡的候选节点。

为什么这题得用三代：研究者的核心假设是"AS 的发病不只在基因表达量上，还在 isoform 与剪接层面"。短读长测序只能算到基因层面的总量，isoform 使用比例和剪接事件基本推不出来；一条读长贯通转录本首尾的长读长测序，才能把这三层同时量出来，也让 26 个核心基因的筛选有了 isoform 级别的证据。

08

常见问题

已经有短读长转录组数据了，还有必要做全长吗？
看问题出在哪一层。如果差异在基因表达量层面，短读长足够，性价比也更高。如果关心的是 isoform 结构、剪接事件、APA 位点、融合基因，或者物种本身注释不全，短读长只能靠组装推测，全长测序给出的是实测结构。常见的做法是先跑短读长做定量和筛选，再对关键样本或关键基因补长读长定结构。
ONT-lrRNA-seq 和 ONT-DRS 怎么选？
两者读的都是全长，差别在于测的是 cDNA 还是 RNA 本身。lrRNA-seq 走逆转录 + PCR，产出稳定、所需 RNA 量少（≥2 µg），适合 isoform、剪接、APA、融合基因这类结构问题。DRS 不逆转录、不扩增，直接测天然 RNA 分子，能同时看到 RNA 碱基修饰（m6A 等）和 poly(A) 尾长度，代价是所需 RNA 量大得多（≥50 µg）。想看修饰，只能选 DRS。
能不能只寄提取好的 RNA？
可以，但不建议。RNA 在提取、分装、干冰运输环节里降解风险高，一旦 RIN 掉到 7 以下就要重新取样。寄组织或细胞，由我方在实验前统一提取质检，样本不合格可以当场发现，比寄到手里才发现降解要省时间。确实只能寄 RNA 时，请一并提供浓度、OD260/280 和电泳或 2100 的质检结果。
非模式物种、没有参考基因组能做吗？
能做，而且长读长在这类项目上优势最明显。没有参考基因组时可以用 de novo 方式直接从全长 reads 得到转录本集合，再做功能注释；有近缘物种基因组时也可以比对过去。请提前说明物种、倍性和组织类型，方便评估 RNA 提取难度（植物、真菌、高多糖高酚样本需要调整方案）。
RIN 达不到 7.0 怎么办？
先看是哪一类样本。部分特殊物种本来就没有明显的 28S 条带，RIN 算法会失真，这种情况以 Agilent 2100 的基线是否平整为准。真降解的样本建议重新取样，不要勉强上机——长读长对完整性更敏感，降解样本会直接表现为 reads 变短、全长比例下降，数据用不上。
需要多少生物学重复？
做差异表达分析建议每组至少 3 个生物学重复，和短读长的要求一致。只是做转录本结构普查、完善基因注释的话，1–2 个样本也能出结果，但结论只能描述"存在哪些 isoform"，不能做组间统计推断。
项目周期多久？
样本与 RNA 质检合格后，建库测序约 3–4 周，标准分析约 2 周。融合基因验证、与短读长数据联合分析、可变剪接与预后关联等高级分析按需求另行约定。
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