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Oxford Nanopore · 三代测序

简化代表甲基化多重测序
ONT-RRMS

全基因组甲基化测序（WGBS）要把整个基因组测一遍才够，成本大部分花在你不关心的区域上。RRMS 的做法是在测序当时做选择：DNA 分子刚进纳米孔、前几百个碱基被测到的那一瞬间，仪器就判断它是不是目标区域，不是就反向电压弹出去，把孔位让给下一个。

  • 无需亚硫酸氢盐
  • 单碱基分辨率
  • 5mC / 5hmC / 6mA
  • 同时出 CNV / SV / SNP
  • 人 310 Mb 靶向区域
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310Mb人靶向区域（小鼠 308 Mb），富含 CpG
718万个 CpGbed 文件记录的 CpG 位点数
≥10µg DNAgDNA 起送量
4类修饰5mC、5hmC、6mA、4mC
01

技术简介

DNA 甲基化是 DNA 甲基转移酶（DNMT）把甲基加到胞嘧啶上、形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC）的表观遗传修饰，通常会抑制基因转录。CpG 位点（序列上相邻的一个 C 和一个 G）在基因组里不是均匀分布的，而是密集聚集在被称为 CpG 岛（CGI）的区域；脊椎动物大多数基因的启动子就落在这些 CpG 岛里。启动子区域的甲基化状态变化，和基因表达以及肿瘤等疾病状态直接相关——比较肿瘤与正常样本之间的甲基化差异，是找调控机制的一条常用路径。

测甲基化位置，传统上靠亚硫酸氢盐测序（BS-seq）：用化学处理把未甲基化的 C 转成 U，甲基化的 C 保持不变，测序后比对出差异。问题在于 BS-seq 需要很大的数据量才能覆盖全基因组，而成本更低的简化方案 RRBS（用限制性内切酶切出富 CpG 片段）只能覆盖基因组约 1–5% 的 CpG 位点。

纳米孔测序可以直接检测胞嘧啶的甲基化状态，不需要亚硫酸氢盐转化——甲基会改变碱基穿孔时的电流信号，仪器从信号里读出来。剩下的问题是怎么把测序能力集中到 CpG 密集的区域。RRMS 用的办法是自适应采样（Adaptive Sampling, AS）：在测序过程中优先丢弃非目标区域的分子，从而提升目标区域（如 CpG 岛）的覆盖度。

按 RRMS 方案，测序针对人类基因组中富含 CpG 的 310 Mb 区域（小鼠为 308 Mb），内容包括所有已注释的 CpG 岛、shores、shelves 以及超过 90% 的启动子区域（含有 4 个以上 CpG 的启动子则 100% 覆盖），此外还包含基因组中其他富 CpG 的区域。配套的 bed 文件共记录 718 万个 CpG 位点。

ONT-RRMS 原理与建库流程：提取 gDNA、片段化至约 6 kb、末端修复、连接测序接头、自适应采样测序
ONT-RRMS：片段化 → 末端修复 → 连接接头 → 自适应采样测序
02

技术优势

简单方便

不需要化学试剂转化，也不需要做限制性内切酶处理。少了亚硫酸氢盐这步，DNA 不会被化学处理打断降解，对样本量的压力小很多，实验环节也少。

覆盖度高

人靶向测序区域 310 M，小鼠靶向测序区域 308 M。相比 RRBS 只覆盖 1–5% 的 CpG 位点，这个覆盖面把 CpG 岛之外的 shores、shelves 和大部分启动子都装进来了。

多种甲基化修饰

5mC、5hmC、6mA、4mC 等一次测出。亚硫酸氢盐路线有一个已知短板：5mC 和 5hmC 在化学处理后区分不开；纳米孔按电流信号区分，两类能分开。

变异分析

可以同时分析 CNV、SV 和 SNP。同一批数据既出甲基化又出变异，不用为结构变异单独建库——这是长读长相对短读长甲基化方案的一个实际好处。

单碱基分辨率

可以在单碱基水平检测甲基化状态，并支持表观单倍型（allele-specific methylation）分析——同一条 read 上的甲基化状态连着看，能区分来自父本还是母本等位基因。

03

技术原理

自适应采样是纳米孔平台特有的功能，靠软件控制实现富集。流程是这样的：DNA 分子在马达牵引下开始穿孔，仪器先读它最初几百个碱基，把这几百个碱基与预先设定的靶向区域（本方案就是那份 718 万个 CpG 位点的 bed 文件）做比对。

比对结果是二选一：这个分子落在目标区域，就让它完整通过、正常测序；不在目标区域，软件立刻反转纳米孔两端的电压，把这条分子从孔里弹出去，孔位随即空出来给下一个分子。

好处很直接：不用在实验台上做捕获或富集，省掉一整轮探针杂交和洗脱操作；同一张芯片的测序能力被集中用在你关心的区域上，等效覆盖深度明显提高。想换目标区域，改 bed 文件重新上机就行，不用重做样本。

04

实验流程

1

提取基因组 DNA

提取高质量 gDNA，总量需达到送样门槛

2

片段化

对 DNA 进行片段化，打断后平均长度约 6 kb

3

末端修复

修复打断后 DNA 的末端

4

连接接头

连接测序接头

5

RRMS 自适应采样测序

ONT 测序仪运行自适应采样程序，加载 bed 文件锁定富 CpG 区域（人 310 Mb / 小鼠 308 Mb，含 718 万个 CpG 位点），实时「留 / 弹」目标分子

两个关键设计：① 片段平均长度控制在 6 kb 左右，是为了同时兼顾两件事——够长，才能跨过重复区域、支撑 SV 与单倍型分析；够短，才能在自适应采样判读最初几百个碱基时快速给出「留 / 弹」的决定，减少孔位浪费。② bed 文件圈定的是人和小鼠基因组的富 CpG 区域，测序时非目标区域的分子会被实时丢弃，孔位集中在甲基化信息最密集的区段上。

05

送样要求

DNA 的完整性是这类项目的关键——长片段比例不够，自适应采样的效率和后续 SV 分析都会受影响。

样本类型ONT-RRMS说明
DNA 总量≥10 µg高于常规 gDNA 测序（≥5 µg），因为自适应采样会主动丢弃一部分分子
DNA 纯度OD260/280 1.7–1.9；OD260/230 2.0–2.2230 比值偏低通常提示有胍盐、酚或糖类残留
DNA 完整性核心琼脂糖凝胶电泳 5 kb 以下无小片段；片段大小检测仪器（Qseq / Agilent 2100）在 5 kb 以下无明显峰这一步不合格的样本最常见，建议送样前先自检
细胞≥2×10⁷ 个由我方提取 gDNA 更稳妥
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥100 mg取新鲜组织，块尽量 ≤0.5 cm；去除结缔组织与脂肪；预冷 1×PBS 或生理盐水洗去血迹，液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输，避免反复冻融
动物组织 · 肝、脾、胃≥40 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥200 mg
植物组织≥2000 mg植物多糖多酚会干扰 DNA 提取，取样量需加大
全血4 mL按血液样本常规采血管要求采集与运输
免疫细胞干体积 ≥20 µL一般 10 µL 细胞干体积对应约 1×10⁶ 个细胞
最常见的送样失败原因：DNA 提取时机械打断过度，或者反复冻融导致片段变短。这类样本电泳看主带还在，但 5 kb 以下已经有一片拖尾，上机后自适应采样命中率低、SV 检不出。建议提取时轻柔操作、避免剧烈涡旋，宽口枪头吹打而非反复吸打；分装保存，一次取用一管。完整版要求以最新版《送样规范》为准。
06

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 数据质控与靶向区域统计reads 质控、靶向区域富集倍数、目标区域覆盖深度
  2. 甲基化位点检测5mC / 5hmC / 6mA / 4mC 的单碱基甲基化状态判定
  3. 甲基化水平统计CpG 位点甲基化比例、基因与启动子区域甲基化水平
  4. 差异甲基化分析组间差异甲基化位点（DMS）与差异甲基化区域（DMR）
  5. 区域注释与富集DMR 落在启动子 / CGI / shores / shelves 的分布与功能富集

高级分析 ADVANCED

  1. 表观单倍型分析同一条 read 上的甲基化状态连读，区分等位基因来源
  2. 等位基因特异性甲基化印记区域与等位基因差异甲基化识别
  3. 变异检测联合同一批数据出 CNV、SV、SNP，与甲基化结果交叉
  4. 甲基化与表达关联启动子甲基化水平与对应基因表达量的关联分析
  5. 肿瘤 vs 配对正常比较配对样本的 DMR 筛选与候选基因优先级排序
07

应用案例

案例一
IF 15.7 Nature Communications · DeepMod2

A signal processing and deep learning framework for methylation detection using Oxford Nanopore sequencing

基于牛津纳米孔测序的甲基化检测信号处理与深度学习框架

期刊：Nature Communications（IF 15.7）　·　发表时间：2024 年
研究团队：美国宾夕法尼亚大学
阅读原文：doi.org/10.1038/s41467-024-45778-y

DeepMod2 深度学习框架：利用纳米孔离子电流信号检测 DNA 甲基化
DeepMod2：从纳米孔电流信号直接检测 DNA 甲基化

研究发现：作者开发了 DeepMod2，一个用纳米孔测序离子电流信号检测 DNA 甲基化的深度学习框架。它能在 CPU 上高效运行，可以推断表观单倍型，也可以直接做甲基化判定。与闭源工具 Guppy 和 Dorado 相比，性能相当，且是开源的。

全基因组与 RRMS 纳米孔测序的 reads 及甲基化调用 IGV 图，比较 RRMS reads 覆盖与 CpG 检出数量
IGV 图：RRMS 在靶区内的 CpG 检出量显著高于全基因组测序

数据表现：图中展示了全基因组与 RRMS 两条路线的 reads 和甲基化调用，并比较了 RRMS 的 reads 覆盖。用 DeepMod2 在 HG002 的 RRMS 数据中检测 5mC：CpG 基序内的胞嘧啶，全基因组范围内检出 39 个，靶区内检出 1,399 个；汇总到 CpG 位点层面，全基因组 248 个，靶区 717 个。RRMS 区域内检出的聚合 CpG 数量也明显多于靶区外的 CpG。

ONT RRMS 与 WGS 数据集的覆盖范围和甲基化水平对比，以及 RRMS CpG 与全部 CpG、RRMS 靶区的轨迹
RRMS 轨迹与覆盖峰重合，靶区相对靶外区域明显富集

覆盖度验证：图中展示了 ONT RRMS 与 WGS 数据集的覆盖范围和甲基化水平，以及 RRMS CpG 与全部 CpG 的轨迹、RRMS 靶区轨迹。可以看到 RRMS 轨迹和覆盖峰重合，靶区相对靶外区域存在明显富集——这正是自适应采样在测序端做选择的效果。

08

常见问题

和 WGBS、RRBS 相比，RRMS 的定位是什么？
三条路线各有取舍。WGBS 覆盖最全，但要把整个基因组测到足够深度，数据量与成本都高，而且亚硫酸氢盐处理会降解 DNA。RRBS 最便宜，靠限制性内切酶切出富 CpG 片段，但只覆盖约 1–5% 的 CpG 位点，CpG 岛之外基本看不到。RRMS 折中：靶向 310 Mb 的富 CpG 区域（含全部 CGI、shores、shelves 和 90% 以上启动子），不做化学转化，同时还能出 CNV、SV、SNP。
不做亚硫酸氢盐转化，甲基化结果可靠吗？
原理不同，各有验证方式。亚硫酸氢盐靠化学反应区分甲基化与未甲基化；纳米孔靠甲基引起的电流信号差异判定。可靠性通常用三层来保证：用已知甲基化状态的标准品（如 HG002 这类有公认甲基化图谱的参考样本）校准；与 WGBS 或芯片结果做交叉比对；用修饰酶敲除样本做负对照。案例里的 DeepMod2 就是在 HG002 上做的性能比对。
5mC 和 5hmC 能分开吗？
能，这是纳米孔路线相对亚硫酸氢盐的一个实际优势。常规 BS-seq 里 5mC 和 5hmC 在化学处理后表现一致，要分开得额外做氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-seq）。纳米孔按电流信号区分，两类可在同一次实验中分别判定。
靶向区域能自己定吗？
能。默认用富 CpG 的 310 Mb（人）/ 308 Mb（小鼠）区域，包含全部注释的 CpG 岛、shores、shelves 和 90% 以上启动子。如果你的课题聚焦特定基因集、印记区域或某个染色体区段，可以换成自定义 bed 文件上机——换 bed 不用重做样本，这是自适应采样相对实验端捕获的一个便利之处。请提前把目标区域发给技术顾问评估大小和可行性。
为什么强调 5 kb 以下不能有片段？
两方面的原因。一是自适应采样靠长 reads 提效：片段太短，一条 read 测完也进不了几个目标 CpG，孔位利用率下降。二是SV 与单倍型分析需要长片段：短片段跨不过重复区域和结构变异断点，表观单倍型也连不起来。所以送样规范里把"5 kb 以下无小片段"单列为核心指标。
需要几个生物学重复？
做差异甲基化分析建议每组至少 3 个生物学重复；肿瘤 vs 癌旁这类配对设计可以用配对样本做统计，重复数要求会低一些，但仍建议不少于 3 对。
项目周期多久？
样本与 DNA 质检合格后，建库测序约 4-5 周，标准分析约 2 周；表观单倍型、等位基因特异性甲基化、甲基化与表达关联等高级分析按需求另行约定。
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