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单细胞测序 · 微量细胞解决方案

Smart-seq2 微量细胞全序列转录组测序

细胞量很少、样本很难得的时候，通用方案往往测不动。Smart-seq2 是面向这类微量细胞的单细胞转录组解决方案：基于模板转换机制合成完整转录本，对 RNA 输入量要求更低，还能应对低质量 RNA，把有限的那点细胞测出足够的信息量。

  • 微量细胞解决方案
  • 全序列转录本覆盖
  • 适用低质量 RNA
  • 低输入量友好
  • 单细胞分辨率
获取本技术方案 → 查看送样要求
全序列转录本获取细胞基因完整转录本信息
1,000个细胞起活细胞加入指定裂解液 −80 ℃ 保存
低质量RNA 可做对 RNA 输入量要求更低
高灵敏度捕获基因表达信息表现更为灵敏
01

技术简介

SMART-seq（Switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript）是 2012 年开发的一种单细胞转录组测序技术。它的原理是通过在反转录过程中引入一个定制引物，将细胞内的 RNA 转录本进行全长合成，使得可以获得单细胞水平上更详细和全面的基因表达数据。

2013 年，Nature Methods 杂志上报道了 Smart-seq2，该技术是经 SMART-seq 改进的一种测序方法，以提高单细胞 RNA 测序的效率和覆盖度。Smart-seq2 的引物设计更加精确，可以更好地应对低质量 RNA 样本，并且在捕获基因表达信息时表现更为灵敏。

这两点放在一起，就是它作为微量细胞解决方案的由来：细胞可以少，RNA 可以差一点，但每个细胞拿到的信息量要足够——因此适合细胞数量受限、样本难得的课题。

Smart-seq2 原理：模板转换机制合成全长 cDNA
Smart-seq2：模板转换机制实现全长 cDNA 合成
02

技术优势

全长转录本测序

获取细胞基因完整转录本信息，准确了解单细胞基因表达谱。

适用性广泛

适用于多种细胞类型和样本，包括低质量单细胞 RNA——引物设计更精确，对样本状态波动的耐受度更高。

单细胞分辨率

具备高单细胞分辨率，能深度探索细胞异质性和亚群结构，发现被群体平均掩盖的稀有细胞类型。

低输入 RNA 样本

对 RNA 输入量要求更低，适用于限制性细胞样本——细胞数量本来就少的课题（微量分选细胞、穿刺样本、脑脊液细胞等）是它最典型的应用场景。

03

技术原理

该技术通过设计 oligo(dT)VN Primer 作为逆转录引物，利用 MMLVRT 的模板转换活性，在 cDNA 的 3′ 端添加一段接头序列，通过该接头序列进行反转录，生成 cDNA 第一条链。

当逆转录酶到达 mRNA 5′ 末端时，会连续在末端添加几个胞嘧啶（C）残基。然后添加 TSO 引物，退火后结合在第一条链的 3′ 端与 poly(C) 突出杂交，合成第二条链。

这样得到的 cDNA 经过 PCR 扩增，获得纳克级的 DNA，纯化后可用于测序。由于模板转换发生在 mRNA 的 5′ 末端，最终 cDNA 覆盖完整转录本，而不是只覆盖 3′ 端片段。

04

送样要求

活细胞需加入指定裂解液并于 −80 ℃ 保存，请按细胞悬液 / 组织两类分别准备。

样本类型送样量说明
活细胞1-1,000 个加入指定裂解液，−80 ℃ 保存；建议提供分选标志与预期细胞亚群信息
新鲜动物组织解离 · 心、脑、肾、肺≥50 mg新鲜组织取样后尽快解离；解离方案按组织类型调整，易存在坏死和钙化的组织（肿瘤、斑块、滑膜、心脏瓣膜等）建议先解离再提核
新鲜动物组织解离 · 肝、脾、胃≥50 mg
新鲜动物组织解离 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥100 mg
冻存动物组织抽核 · 心、脑、肾、肺≥50 mg冻存组织需液氮速冻后 −80 ℃ 保存、干冰运输；一个月内进行处理；所有冻存样本均需提 RNA 质检是否降解
冻存动物组织抽核 · 肝、脾、胃≥50 mg
冻存动物组织抽核 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥100 mg
植物组织≥0.5 g选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输
样本类型怎么选：① 已分选的细胞悬液最直接，加入指定裂解液 −80 ℃ 保存即可；② 新鲜组织需尽快解离，当天干冰运输到实验室当天处理；③ 冻存组织走抽核路线，干冰运输、一个月内处理。样本太小时可先与技术顾问评估细胞量是否足够。

完整版要求以最新版《送样规范》为准，寄样前可先与技术顾问确认。

05

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 原始数据质控reads 质量、接头与长度分布评估
  2. 比对与定量比对参考基因组 / 转录组，输出基因表达量矩阵
  3. 细胞质控与过滤低质量细胞剔除、双胞检测
  4. 降维与聚类PCA / UMAP / t-SNE，细胞亚群鉴定
  5. Marker 基因与注释亚群特异表达基因鉴定与细胞类型注释

高级分析 ADVANCED

  1. 差异表达分析亚群间 / 组间差异基因筛选与功能富集
  2. 拟时序与轨迹细胞分化轨迹与状态转换推断
  3. isoform 与剪接全长覆盖优势下的转录本结构分析
  4. 基因共表达网络WGCNA 等模块分析，关联表型
  5. 多组学整合与 bulk RNA-seq、空间转录组联合分析
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应用案例

案例一
IF 6.8 Clinical and Translational Medicine · 脑脊液 CTC

Circulating tumor cell characterization of lung cancer brain metastases in the cerebrospinal fluid through single-cell transcriptome analysis

通过单细胞转录组分析表征脑脊液中肺癌脑转移的循环肿瘤细胞

期刊：Clinical and Translational Medicine（IF 6.8，2024 JCR）　·　发表时间：2020 年
阅读原文：doi.org/10.1002/ctm2.246

样本与方法：2020 年，上海复旦大学华山医院、同济大学附属东方医院、美国 Auburn University 等单位的研究人员建立了一种有效的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）收集方法，从 5 例肺腺癌柔脑膜转移（LUAD-LM）患者和 3 例对照组中分离出单个脑脊液细胞。利用 Smart-seq2 技术对 3,792 个细胞进行单细胞测序，对脑脊液细胞的基因表达情况进行了全面表征。

研究发现：过滤掉低质量细胞后，文章分析了 207 个正常脑脊液细胞、41 个 B 细胞、41 个 T 细胞，平均每个细胞检测到 803 个基因表达。聚类分析发现正常淋巴细胞在不同微环境下具有相似的表达谱；正常脑脊液样本未发现 B 细胞。该研究建立了 CSF-CTCs 的收集与单细胞表征流程，为柔脑膜转移的无创监测提供了方法学基础。

案例二
IF 7.9 Genomics Proteomics & Bioinformatics · 平台比较

Direct Comparative Analyses of 10X Genomics Chromium and Smart-Seq2

10x Genomics Chromium 与 Smart-seq2 的直接比较分析

期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics（IF 7.9，2024 JCR）　·　发表时间：2021 年
阅读原文：doi.org/10.1016/j.gpb.2020.02.005

样本与方法：2021 年 3 月，北京大学张泽民教授团队发表该研究，使用 Smart-seq2 和 10x Genomics Chromium 两种单细胞转录组测序技术，对一名肝细胞癌（HCC）患者的肝癌（LT）及癌旁（NT）组织，和一名直肠癌伴肝转移患者的直肠癌（PT）与肝转移（MT）组织中流式分选出的 CD45⁻ 细胞进行比较分析，从多个角度分析二者差异，为单细胞转录组测序技术的选择与应用提供了基础。

研究发现：10x 中 dropout 率高于 Smart-seq2——以 LT 细胞中的 HK 基因为例，10x 中 dropout 率也高于 Smart-seq2，且表达水平较低的基因具有更高的 dropout 率。在 10x 中，从较少数量的细胞中检测到丰度较低的基因，这些基因可能导致更高的噪音。作者还发现基因表达变异系数（CV）与 dropout 率相关：具有较大 CV 的基因通常表达较低，对 10x 尤其明显，同时具有较高 dropout 率。这些结论对项目选型有直接参考价值。

07

常见问题

Smart-seq2 和 10x Genomics 怎么选？
看细胞量与研究目标。Smart-seq2 是面向微量细胞的方案：通量低（数百到数千细胞），但覆盖度高、对 RNA 输入量要求更低，适合细胞数量受限、需要把每个细胞测深、或需要完整转录本信息的课题；10x 通量高（数千到数万细胞），适合大队列细胞图谱与稀有亚群发现，但 dropout 率更高。案例二做过两者的直接比较，低表达基因在 10x 中 dropout 更明显，可直接参考。
需要多少细胞？
送样规范中活细胞为 1-1,000 个（加入指定裂解液，−80 ℃ 保存）。若走组织解离或冻存组织抽核路线，按组织类型准备 ≥50–100 mg。样本量确实不足时，建议先与技术顾问评估。
"微量细胞解决方案"具体指什么？
指细胞数量本身就受限的课题——分选出来的细胞只有几百到几千个、临床穿刺或脑脊液样本、某个稀有亚群分完就所剩无几。这类样本用高通量方案往往凑不够上机要求，Smart-seq2 的低 RNA 输入量与高覆盖度正好对得上：细胞少，但每个细胞测到的基因数更多、信息更完整。案例一中，研究者正是用它对脑脊液里分离出的细胞做单细胞测序。
组织样本怎么送？
分两种情况。新鲜组织：尽快解离，当天干冰运输到实验室当天处理；易存在坏死和钙化的组织（肿瘤、斑块、滑膜、心脏瓣膜等）建议先解离再提核，可去除一部分杂质、降低上机堵芯片风险。冻存组织：修剪出目的区域、无菌纸巾吸掉表面水分，液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输，一个月内处理；所有冻存样本均需提 RNA 质检是否降解。
RNA 质量不高能做吗？
Smart-seq2 的一个优势就是能更好地应对低质量 RNA 样本——引物设计更精确，对 RNA 输入量要求也更低。但"能应对"不等于"无上限"，若样本已严重降解，仍建议提前提供 RIN 或 2100 图谱，由我们评估。
每个细胞能测到多少基因？
与细胞类型、大小和测序深度都有关。案例一在脑脊液细胞中平均每个细胞检测到 803 个基因（脑脊液细胞本身转录活性较低）；在转录活跃的细胞类型中通常可达数千个基因。项目启动时可按目标基因数反推所需测序深度。
可以只送分选后的细胞吗？
可以，这是最推荐的送样方式。流式分选或磁珠分选后的细胞直接加入指定裂解液，−80 ℃ 保存。请一并提供分选标志物、预期细胞亚群与分选策略，便于我们在分析阶段验证分群是否符合预期。
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