分子实验检测

在课题里的位置各有不同：细胞模型构建和细胞功能实验做完之后，qPCR／FISH／双荧光素酶常用来解释"为什么"；动物实验或临床样本的整体评估，多配生化检测。做不做、做几项，跟着课题设计走，不必凑齐。

PCR 每完成一个循环，产物就多一点。qPCR 是在体系里加荧光染料或探针，每个循环读一次荧光，把"产物随循环数增长"这条曲线实时画出来。曲线越过阈值时的循环数就是 Ct：起始模板越多，越早越过阈值，Ct 越小。

所以 Ct 本身不是表达量，要先用内参基因归一化、再和对照组比，才得到相对表达量（2^−ΔΔCt）。真正决定这一次 qPCR 能不能用的，是三个前置条件：RNA 质量、引物特异性、内参选择——RNA 降解会让 Ct 整体后移，引物不特异会让熔解曲线出双峰，内参在处理条件下变了，所有结论跟着偏。

FISH（荧光原位杂交）是用荧光基团标记一段与靶序列互补的核酸探针，进到细胞里与靶 DNA 或 RNA 杂交，再在荧光显微镜或共聚焦下看信号。信号出现在哪个位置、有多少个点、和哪个蛋白重叠，都是信息——这是把样本磨碎做 qPCR 拿不到的东西。

做 DNA 的 FISH 看染色体层面的事：基因重排与融合、扩增、缺失、着丝粒计数。做 RNA 的 FISH 看转录本在细胞里的分布：核内还是胞质、有没有聚成点、和某个蛋白是否共定位。后者常和免疫荧光一起做——探针给 RNA，抗体给蛋白，一张 Merge 就能说明"这两个东西在同一个位置"。

报告基因实验回答的是一个很具体的问题：这段序列和这个因子之间，有没有直接作用。做法是把待验证的序列挂到萤火虫荧光素酶（Firefly）基因的上游或下游，转进细胞看酶活变不变；同时转一个海肾荧光素酶（Renilla）作内参，用两者比值消除转染效率和细胞数带来的组间误差。

两条常用路线：① 启动子区——把靶基因的 5' 启动子或转录因子结合元件克隆到 Luc 上游，与转录因子过表达质粒共转；野生型荧光升高、结合位点突变型不升高，说明这个位点就是该转录因子的作用位点。② 3'UTR——把 3'UTR 或 lncRNA 结合序列克隆到 Luc 下游，与 miRNA mimics 共转；野生型荧光下降、突变型不变，说明 miRNA 通过这个位点调控。

血清、血浆、组织匀浆、细胞培养液、灌流液里的代谢物和酶活，都能用生化分析仪测出来：血糖、甘油三酯、总胆固醇、HDL／LDL，肝功能（ALT、AST、ALP、TP、ALB），肾功能（BUN、Cr、UA）等等。原理多是比色或酶偶联反应——反应产物的颜色深浅与待测物浓度成正比，仪器读吸光度换算成浓度。

这类指标看着简单，结果却最容易被样品处理决定：溶血、抗凝剂类型、组织匀浆的稀释倍数、冻融次数，都会让数字变样。所以我们动手前先确认样品类型和保存条件；匀浆样品同时测蛋白浓度做归一化，不靠"差不多取了同样多的组织"。