细胞模型构建

这三件事经常被混在一起问：我这个基因要不要敲、要敲到什么程度、用什么手段做。顺序其实很简单——先看目的，再选手段。下面这张表是三个方向的实际差别。

细胞系共享、身份错配、支原体污染——这三件事毁掉的实验，比技术难度本身多得多。所以我们把培养当成项目的第一道质控，而不是"顺手养一下"。

每个细胞都带一张"身份证"

• 人源细胞系STR 鉴定报告，与数据库比对确认身份。
• 非人源细胞系种属鉴定报告，排除种属混用与交叉污染。
• 原代细胞免疫荧光鉴定报告，确认目标细胞类型的纯度。

细胞均来源于国内外可靠细胞库。这一步看着繁琐，但它是后面所有结果能被重复的前提——审稿人问"你怎么确认这是这个细胞"时，报告就是答案。

环境受控：10 万级细胞培养洁净室

支原体：从源头到清除，三段都有动作

支原体污染最麻烦的地方是不显形——细胞照样长，实验照样出结果，但数据已经不可信了。我们的做法分三段：

研究一个基因的功能，最常用的手段就是把它敲低或过表达，再看转录组、通路和表型怎么变。两条路：瞬时转染（质粒 / shRNA / siRNA）和慢病毒感染制备稳转模型。差别不在"哪个更先进"，而在你的细胞吃哪一套。

难点也在这儿：不同细胞要不同的转染条件；同一个基因，选敲低还是过表达取决于你问的问题；而质控能不能过关，直接决定后面测序和表型数据可不可信。

整个过程五步，每一步都留痕

百余种细胞的培养与转染经验

下面按科室／疾病方向列了我们实际做过的细胞，包含但不限于此。同一株细胞在不同实验室的转染效率能差一倍，所以这张表的用处是：如果你的细胞在表里，说明条件基本摸好了。

以人脐静脉内皮细胞 HUVEC 的慢病毒敲低为例，四道质控依次过。这也是我们判断一个模型能不能往下交的标准。

四道质控，判定线写清楚

• RNA 完整性RQN／RIN ≥7；琼脂糖凝胶三条带清晰，28S 亮度约为 18S 的两倍。
• RNA 纯度与总量A260/280 在 1.8–2.2，A260/230 在 1–2；总量 ≥2 µg，浓度 ≥100 ng/µL。
• qRT-PCRmRNA 水平敲低 70% 以上，且 T 检验有显著性。
• Western Blot目的蛋白水平同步下降，灰度值差异显著。

敲低是"少一点"，敲除是"没有"。CRISPR/Cas9 直接在基因组层面动手：在目的基因上下游各设计一条向导 RNA（sgRNA），和携带 Cas9 的质粒一起转入细胞。sgRNA 通过碱基配对靶向 PAM（NGG）上游的序列，Cas9 的两个核酸酶结构域把双链切断；细胞自身的 DNA 损伤修复机制把断口两端接起来，中间那段就丢了——目标基因被精确敲除。

什么时候非敲除不可

• 结论要求"完全无蛋白"敲低常残留 10–30% 的表达，碰上蛋白半衰期长、抗体特异性一般的情况，残留足以干扰判断。
• 目标是长非编码 RNA可敲除 3000 nt 以上的片段，lncRNA、miRNA 簇这类用敲低压不下去的，敲除才有意义。
• 要长期用、要进动物敲除细胞系是稳转的，能反复传代、冻存建库，后续接动物成瘤或移植实验都方便。
• 要减少脱靶争议双 sgRNA 造成片段缺失，配合单克隆测序验证，比单点编辑更好解释——审稿人问脱靶时手里有证据。