细胞功能实验

这些表型实验通常接在细胞模型构建后面：先敲低、过表达或敲除，确认模型质控过关，再上表型。顺序反了，表型一好看就没人去查模型真假。

CCK-8 里的核心成分是 WST-8。它被活细胞线粒体里的脱氢酶还原，变成水溶性的橙黄色甲瓒（formazan），颜色深浅与活细胞数量成正比，在 450 nm 读吸光度就能定量。细胞增殖越快、活细胞越多，颜色越深；细胞毒性越大，颜色越浅。

和 MTT 比，差别在"要不要溶"：MTT 的甲瓒是脂溶性的，得用 DMSO 溶解才读得出，多一步、也有毒性；WST-8 的产物直接溶在培养基里，加进去孵育、上机读数就行。另外 MTT 的线性范围窄（吸光度 1 左右），CCK-8 到 3 以内基本还在线性段，做药物梯度时不容易"顶到头"。

单个细胞在体外连续分裂 6 代以上，后代堆成 50 个细胞以上、直径 0.3–1.0 mm 的一团，才算一个克隆。克隆形成率 = 长成克隆的细胞数 ÷ 接种细胞数，本质是"接种存活率"。

为什么不能只做 CCK-8？因为克隆形成率同时反映贴壁能力和增殖活力——贴上去的细胞不一定都能长成克隆，但能长成克隆的一定是贴得住、也长得动的。CCK-8 只是把当时孔里的活细胞数读出来，看不出"这一个细胞还有没有后续"。做药物长期处理、或者要证明"增殖能力被永久性削弱"，克隆形成比 CCK-8 更站得住。

细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束，走完间期（G0/G1 → S → G2）和分裂期（M）。要判断细胞停在哪儿，最常用的办法是量每个细胞里的 DNA 含量：PI 染双链 DNA，荧光强度与 DNA 量成正比，再用流式逐个读。

读出来就两峰一谷：G0/G1 期是 2N（左边那个峰），S 期在 2N–4N 之间（中间那段连续分布），G2/M 期是 4N（右边那个峰）。PI 同时也会染 RNA，所以必须先用 RNase 把 RNA 消化掉，不然 S 期比例会虚高。

正常细胞的磷脂酰丝氨酸（PS）只待在内膜侧。凋亡早期，PS 会翻到外膜，Annexin V 能结合 PS，所以荧光标记的 Annexin V 就是凋亡的"外翻探针"。但膜一破，Annexin V 也能钻进去染坏死细胞——单靠它分不清凋亡和坏死，所以要加 PI：PI 进不了完整细胞膜，只能染膜已经破了的细胞。

两个一起染，流式图就分成四群：左上 Q1 Annexin V−／PI+ 是坏死，右上 Q2 双阳是晚期凋亡（继发性坏死），左下 Q3 双阴是活细胞，右下 Q4 Annexin V+／PI− 是早期凋亡。报"总凋亡率"时，通常是 Q2 + Q4。

上图为与我司合作发表文章的 Fig.1C 与凋亡率定量：Zhou J, Chen W, He Q, et al. PeerJ, 2022, 10: e14084.

装置是上下两室，中间隔一张 8 µm 孔径的聚碳酸酯膜。侵袭比迁移多一步：膜的上侧要先铺一层基质胶，用来模拟细胞外基质。细胞想进下室，必须先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）把胶降解掉，才有孔可钻。穿过膜的细胞固定、结晶紫染色，显微镜下计数——数出来的就是侵袭能力。

这个"多一步"很关键：它把"能跑"和"能破坏组织屏障"分开了。药物或基因处理之后，迁移没变、侵袭掉了，说明影响的是 MMPs 分泌或基质降解，而不是运动能力本身——这个区分在写机制时往往是整段讨论的支点。

同一个装置，膜上不铺胶。上室种细胞、下室加含 FBS 的培养基或特定趋化因子，细胞顺着营养梯度往膜孔里钻、穿到下侧——数穿过去的细胞量，就是迁移能力。8.0 µm 的孔径对多数肿瘤细胞和免疫细胞都合适。

迁移和侵袭常被写在同一段里，但结论不能混：迁移是"运动能力"，侵袭是"运动 + 降解基质"。如果只做了迁移就写"抑制了细胞侵袭"，是这两年被审稿人挑得比较多的一类问题。

细胞长满成单层后，用枪头在中间划一道，洗掉划下来的细胞，形成一个没有细胞的空白区域，然后定点、定时拍照，量这块空白面积怎么缩小。优点是便宜、直观、能看动态过程——同一个孔从 0 h 到愈合全程都有记录，不用重复铺板。

缺点也明确：它同时受迁移和增殖影响，还受血清、细胞密度影响。所以要么在低血清条件下做，要么加增殖抑制剂（如 Ara-C）把增殖摁住，否则"愈合加快"到底是跑得快还是长得快，说不清。另外划痕宽度不均、边缘细胞受损，也会带来假阳性——这也是为什么我们要在同一条划痕上标定边界、按面积而不是按"目测宽度"算。

血管形成时，内皮细胞先伸出突起连成条索，再围成管腔。体外把内皮细胞（HUVEC、HMEC-1 等）铺在基质胶或胶原上，条件合适时它们会在几小时内自己连成网——这就是成管实验（tube formation）。药物或基因处理如果抑制管腔形成、或让已经形成的管断裂，就从侧面说明影响了血管生成。

定量不是靠"看着像不像"，而是用软件量：小管总长度、分支数、节点数、覆盖面积。这几个指标一起看，比单报一个"管腔数"更稳——有的处理会让管变短但分支不变，只报数量就看不出这个变化。

不管做其中一项还是全部八项，交付的内容是同一套——目标是能直接写进文章和标书，而不是一张"看着挺好看"的图。