ITS 测序
真菌看 ITS。真菌核糖体 DNA 的转录单元从 5′ 到 3′ 依次是 18S—ITS1—5.8S—ITS2—28S，中间的 ITS1 与 ITS2 是非编码间隔区，转录后被切除。它们两端紧邻高度保守的编码区（便于设计通用引物），中间承受的选择压力小、进化快，能提供属、种乃至种下水平的区分度。2012 年 ITS 被正式定为真菌界的通用 DNA 条形码，配套参考库 UNITE 的覆盖度也是几个标记里最完整的。
技术简介
真菌的核糖体 DNA 在基因组里以串联重复的多拷贝形式存在，常见从几十到上千个拷贝。ITS1 位于 18S 与 5.8S 之间，ITS2 位于 5.8S 与 28S 之间，两者都不编码，转录后会被切除。这个位置决定了它的双重优势：两边是保守的编码区，可以设计通用引物；自身不受编码约束，变异足够大。
为什么只测一段：ITS 全长在不同类群之间差异很大，约 450–800 bp，部分超过 1,000 bp，短读长平台无法一次通读，所以通常只针对 ITS1 或 ITS2 其中之一建库测序。近全长 ITS（含 5.8S）需要 PacBio CCS 或 Nanopore。
必须知道的四个局限：① 长度变异大——不同类群片段长度差异明显，会影响双端拼接与定量比较；② 种内基因组内异质性——种内不同拷贝之间差异可达约 11.8%，会推高多样性估计，ASV 层面尤其要警惕过度拆分；③ 引物偏好——没有一对引物能均匀覆盖所有真菌；④ 检测的是 DNA——无法区分活体、休眠体与死体残留，也不能直接反映功能活性。
另外，丛枝菌根真菌（Glomeromycota）的 ITS 拷贝高度分化，通常需要改用 18S／SSU 或 LSU 的类群特异引物；Tulasnellaceae（部分兰科菌根共生菌）因 5.8S 末端序列异常，ITS2 几乎扩不出来（实测扩增率接近 0，而 ITS1 约 48%）。这类情况我们在方案阶段就会提醒。
技术优势
真菌分辨率最高的一条路
在属级之上还能往下走到种，部分类群可到种下。相比之下 16S 通常止步于属，18S 更保守——真菌课题要鉴定到种，ITS 是默认选择。
高拷贝，低生物量样本也能建库
串联重复的多个拷贝加上 PCR 放大，让空气滤膜、皮肤拭子这类微生物量极低的样本也有机会测到。代价是这类样本最容易被试剂背景污染，务必配空白对照。
UNITE：唯一带稳定编号的真菌参考体系
UNITE 用物种假说（Species Hypothesis, SH）把序列按 0.5%–3.0% 的动态距离梯度聚类到近似种级单元，每个 SH 有稳定编号并可解析为 DOI。跨研究引用无歧义，这对长期监测类项目特别重要。
片段短，适配主流短读长平台
ITS1 约 350 bp、ITS2 约 400 bp，用 2×250 或 2×300 双端测序即可读通，不需要额外策略。
能给出生态功能类群
配合 FUNGuild 或 FungalTraits，可把注释到的类群归为腐生、共生、病原等生态功能类群，让"有哪些菌"往前走一步，接近"可能起什么作用"。
与 16S／18S 同批并行
同一份 DNA 分出不同标记分别建库，一次采样同时拿到细菌、真核微生物、真菌三套数据，省样本也省偏差。
技术流程
采样
土壤、根际、叶际、植物组织、粪便、空气滤膜等。
破壁提取
机械珠磨 + 化学裂解，专门针对真菌细胞壁。
质检
荧光定量 + 凝胶查完整性与纯度。
区段选择
ITS1（ITS1F/ITS2）或 ITS2（gITS7/ITS4 等）。
PCR 扩增
融合引物带 barcode，高保真酶，控制循环数。
纯化建库
磁珠纯化，定量后等摩尔混池。
测序
Illumina 双端 2×250 或 2×300。
注释与过滤
UNITE 注释后筛出真菌，剔除宿主与空白对照序列。
常用引物对
| 区段 | 引物对 | 产物长度 | 适用与注意 |
|---|---|---|---|
| ITS1 | ITS1F / ITS2 | 约 250–600 bp | 环境样本最常用；ITS1F 能有效压低植物 DNA 的共扩增，适合根、根际、叶片等植物背景高的样本 |
| ITS1 | ITS5 / ITS2 | 同上 | 与 ITS1F 覆盖互补，必要时并行 |
| ITS2 | gITS7 / ITS4 | 约 300–400 bp | 简并引物，真菌覆盖更广，对子囊菌类群表现好 |
| ITS2 | 5.8S-Fun / ITS4-Fun | 约 300–400 bp | 兼顾覆盖与特异性 |
| ITS 全长 | ITS1F / ITS4 | 约 500–800 bp | 长读长平台；参考库完整度仍有限 |
送样要求
真菌 DNA 提取的难点是破壁，样本里抑制物（腐殖酸、多酚）也常比细菌样本多。下面的量是起点，实际按样本类型调整。
| 样本类型 | 送样量建议 | 处理与保存 | 提示 |
|---|---|---|---|
| 土壤 / 根际土 | ≥5 g | 过筛去根系与石块，−80 ℃ 或干冰 | 腐殖酸抑制明显；根际土尽量保留紧贴根系的部分 |
| 植物组织 根 / 茎 / 叶 | ≥1 g 鲜重 | 表面消毒后分装，液氮速冻 −80 ℃ | 内生真菌研究必须做表面消毒，否则全是附生菌 |
| 粪便 / 肠道内容物 | ≥200 mg | 无菌管，速冻后 −80 ℃；干冰运输 | 真菌占比远低于细菌，需评估深度 |
| 空气 / 室内环境 | 滤膜 1–3 张 | 记录采样体积与时间，−80 ℃ | 生物量极低，必须配现场空白与提取空白 |
| 已提取 DNA | 总量 ≥30–50 ng，浓度 ≥5–20 ng/µL | −20 ℃ 或 −80 ℃，干冰运输 | OD260/280 在 1.8–2.0；注明提取试剂盒（建议珠磨法） |
- 建议 ≥6 个生物学重复/组：真菌群落的个体间差异通常比细菌更大，重复少了很难做出统计。
- 同批提取、同批建库：试剂盒批号与操作人差异造成的批效应，下游基本无法纠正。
- 对照必备：提取空白 + 现场空白；条件允许时加 mock 群落（如 ZymoBIOMICS 标准品）评估全流程偏差与嵌合率。
实际要求以最新版本送样规范和项目方案为准。
文献案例
| 期刊 / 年份 | 研究 | 与 ITS 相关的要点 | DOI |
|---|---|---|---|
| Science 2014 |
全球土壤真菌多样性与地理格局 Tedersoo L, et al. |
用 ITS 区高通量测序在全球尺度刻画土壤真菌群落，比较不同生物群区与土壤理化因子下的多样性格局，发现真菌群落同时受气候、土壤与植被共同驱动，且菌根真菌与非菌根真菌的地理分布格局存在明显差异。这项工作奠定了 ITS 作为土壤真菌研究标准标记的地位。 | 10.1126/science.1256688 |
| Microbiome 2017 |
人类微生物组计划健康人群的肠道真菌组 Nash AK, et al. |
对 317 份 HMP 粪便样本做 ITS2 测序（并行 18S 与宏基因组验证）。结论：粪便真菌多样性显著低于细菌；酵母占主导，丰度最高的 15 个属中有 8 个为酵母；Saccharomyces、Malassezia、Candida 高度流行，其中 S. cerevisiae、M. restricta、C. albicans 分别在 96.8%、88.3%、80.8% 的样本中被检出；个体间与同一个体不同时间点均存在明显波动；宏基因组与 18S 结果与 ITS2 相互印证。 | 10.1186/s40168-017-0373-4 |
常见问题
ITS1 还是 ITS2？
丛枝菌根真菌（AMF）能测到吗？
ITS 分辨不到种怎么办？
为什么同一个样本两个区段结果差很多？
测出来的是活菌吗？
注释结果里的 unassigned 比例高怎么办？
低生物量样本怎么避免污染？
获得技术方案
您有任何关于 ITS 测序的项目问题，请留言给我们。技术团队将在工作日 24 小时内给您答复。
寄样收样
李欣 13237124769
武汉市东湖高新区高新二路 388 号光谷生物医药加速器 18 栋 1-2 层
提交您的项目需求
填写以下信息，我们会尽快与您联系并给出技术方案建议。