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微生物组 · 鸟枪法宏基因组

宏基因组测序

不只问"有谁"，还要问"能干什么"。鸟枪法宏基因组直接提取样本的总 DNA、随机打断建库测序，不培养、不扩增特定标记基因，因此天然没有引物偏好。它能一次覆盖细菌、古菌、真菌、病毒与质粒，分辨到种甚至菌株水平，并直接测到功能基因——代谢通路、抗性基因、毒力因子、次级代谢产物基因簇都是实测结果，不是预测。进一步还能做宏基因组装，把未培养微生物的基因组草图（MAG）重建出来。

  • 鸟枪法 Shotgun
  • 种 / 菌株分辨
  • 功能基因实测
  • KEGG · CAZy · CARD
  • MAG 基因组重建
  • 病毒 / 质粒检出
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0PCR 偏好不扩增标记基因
种／菌株可到 SNP 水平
4域细菌 · 古菌 · 真菌 · 病毒
≥2Gb通路级功能参考深度
01

技术简介

鸟枪法宏基因组（shotgun metagenomics）是对样本中存在的所有（"meta-"）微生物基因组做非靶向（"shotgun"）随机测序。直接提取环境或宿主样本的总 DNA，随机打断后加接头建库，上机测到的每一条 read 都可能来自任意一种微生物的任意一段基因组。因为跳过了标记基因 PCR，它不受引物覆盖度与扩增效率的影响。

维度16S／ITS 扩增子鸟枪法宏基因组
测序对象单一标记基因（16S V3–V4、ITS）全部基因组片段
分辨率通常到属，少数到种种乃至菌株 / SNP 水平
类群覆盖仅细菌古菌，或仅真菌细菌、古菌、真菌、病毒、原生生物、质粒
功能信息只能预测（如 PICRUSt2）直接测到功能基因、通路、ARG、VF、BGC
偏差来源引物扩增偏倚为主无 PCR 偏好，但受提取与建库偏倚影响
相对成本低约高 5–10 倍
02

技术优势

1

没有引物偏好，定量更接近真实

不再依赖"通用引物对某一类群恰好好扩"这种运气，扩增效率差异带来的系统性偏差从根上被去掉。这对跨类群比较尤其重要。

2

能到种，甚至到菌株

read 可以比对到基因组特异区域，支持物种级分类、菌株分型以及 SNP 层面的分析。扩增子通常止步于属，这里是一个数量级的差别。

3

功能基因是测出来的，不是猜出来的

代谢通路、抗生素抗性基因（CARD）、毒力因子（VFDB）、碳水化合物活性酶（CAZy）、次级代谢产物合成基因簇（antiSMASH）都能直接定量。扩增子只能做功能预测。

4

病毒、质粒、真菌一网打尽

扩增子只覆盖设计引物时瞄定的那一小撮类群，宏基因组没有这个限制。做噬菌体、病毒组或耐药质粒相关的课题，基本只能走这条路。

5

可以重建未培养微生物的基因组（MAG）

组装 + 分箱能把环境里从未被培养过的微生物基因组草图拉出来，直接拿到它的代谢潜能。这是近十年环境微生物学最大的进展之一。

6

能回答"同一个种里的哪个菌株"

菌株水平的差异往往才是关键——致病株与非致病株、产毒株与不产毒株，在 16S 上完全看不出来。宏基因组配合菌株层面的分析方法是目前最实用的方案。

03

技术流程

湿实验决定"测得到什么"，生信决定"能读出什么"。中间最容易出问题的是DNA 提取和去宿主两步。

1

采样与对照

多点混合成生物学重复，液氮或 −80 ℃ 速冻，严禁反复冻融。

2

DNA 提取

机械裂解（0.1 mm 锆珠）+ 化学裂解双重破壁。

3

去除抑制剂

土壤／沉积物去腐殖酸、多酚等 PCR 抑制物。

4

质检定量

Qubit 荧光定量 + 凝胶或 Agilent 2100 查完整性。

5

去宿主

高宿主样本先做差速离心、选择性裂解或甲基化依赖酶富集。

6

片段化建库

超声或酶切至插入片段 300–500 bp，末端修复、加 A、连接头。

7

文库 QC

查片段分布与浓度，等摩尔混池后上机。

8

测序

Illumina PE150 为主；需要更长连续性时上 PacBio HiFi 或 ONT。

生信分析的两条路线

路线主要工具产出与取舍
基于 reads Kraken2 + Bracken、MetaPhlAn4、mOTUs
HUMAnN3（UniRef90 → MetaCyc 通路）		 快、省算力、跨样本可比，适合大队列与差异分析。缺点是依赖参考库，未知类群检不出；稀有功能容易出现"假零"
基于组装 MEGAHIT / metaSPAdes → Prodigal 基因预测 → CD-HIT 非冗余基因集 → Bowtie2/Salmon 定量 能发现新基因、新酶，是 MAG 的前提。缺点是算力需求大，定量精度因两次比对略有损失
基因组分辨 MetaBAT2 / MaxBin2 / CONCOCT / SemiBin2 → DAS Tool → dRep → CheckM2 / GUNC 重建未培养微生物基因组草图（MAG），按 MIMAG 标准分级。注意即使判为高质量也可能嵌合，菌株级结论需交叉验证
04

送样要求

宏基因组对 DNA 的要求比扩增子高一个量级：量要够，片段要完整，抑制剂要清干净。宿主 DNA 比例是最容易被忽略、也最影响成本的因素。

样本类型送样量建议处理与保存提示
粪便 / 肠道内容物≥200 mg无菌管，液氮速冻后 −80 ℃；干冰运输宿主 DNA 比例通常较低，是最容易做的样本类型
土壤 / 沉积物≥5–10 g过筛去根系与石块，−80 ℃ 或干冰多样性高、抑制剂多，通常需要更深的数据量
水体滤膜 1–3 张0.22 µm 或分级滤膜，记录滤水量；−80 ℃微生物量低，建议现场空白对照
组织 / 拭子 / 体液个案评估−80 ℃／干冰宿主 DNA 常占绝大多数，决定实际有效深度，务必先评估
已提取 DNA总量 ≥1 µg，浓度 ≥20 ng/µL−80 ℃，干冰运输，避免反复冻融OD260/280 在 1.8–2.0；主带完整无明显降解、无色素残留
05

文献案例

期刊 / 年份研究与宏基因组相关的要点DOI
Nature
2010		 人类肠道微生物基因集
Li J, et al. (MetaHIT)		 对 124 名欧洲人的粪便样本做宏基因组测序，建立了包含约 330 万个非冗余基因的人类肠道微生物基因集，其中相当一部分是此前未知的微生物基因。工作还指出不同个体之间共享的菌群基因有限，肠道菌群在功能层面"共性中有个性"。这是宏基因组从方法走向大规模队列研究的转折点。 10.1038/nature08821
Cell
2019		 15 万+ 宏基因组组装基因组揭示未被探索的人体微生物多样性
Pasolli E, et al.		 从覆盖不同年龄、地域与生活方式的人体宏基因组数据中重建了超过 15 万个微生物基因组，聚类为物种水平的基因组单元，其中大部分对应尚未培养的类群。工作同时显示，非西方化人群的肠道微生物多样性被现有参考数据库严重低估——这直接推动了后续 GTDB 与 UHGG 一类统一参考体系的建设。 10.1016/j.cell.2019.01.001
06

常见问题

16S 和宏基因组到底选哪个？
看你要回答什么。只要"谁在那里、占比多少"→ 16S，便宜、流程成熟、适合大队列。要功能基因、耐药基因、毒力因子、病毒组分，或要种／菌株级分辨 → 宏基因组，代价是单价通常高 5–10 倍。预算有限时更常见的做法是16S 普查 + 子集宏基因组。需要注意的是，把 16S 叫做"宏基因组"是用词不当，两者测序对象完全不同。
需要测多深？
由分析目标决定，不要在没想清楚的时候下单。参考上面那张表：只做物种与菌株分型 0.5–1 Gb 就够；通路级功能要 2 Gb；想让单个蛋白可靠检出需要 ≥10 Gb；做 de novo 组装和 MAG 则要 >10 Gb。土壤、沉积物这类高多样性环境还要在此基础上大幅加码。深度不足是宏基因组项目最高频、也最难补救的错误——测完再补样本，批次效应几乎无法消除。
MAG 能到什么程度？可以用来下菌株级结论吗？
按 MIMAG 标准，高质量 draft 要求完整度 ≥90%、污染度 ≤5%，并含 5S/16S/23S rRNA 与 ≥18 个 tRNA；中等质量为完整度 ≥50%、污染度 <10%。现实是基准研究显示，即便被判为高质量的 MAG，也可能有相当比例是嵌合体，真正准确代表原始菌株的比例在约 55%–82% 之间，取决于流程。所以 MAG 更适合用来谈代谢潜能与群落层面的结论；菌株级结论建议用长读长或专门的多态性分析方法交叉验证。
宿主 DNA 占比高怎么办？
先测再定，别靠猜。可选手段包括差速离心、选择性裂解宿主细胞、甲基化依赖的核酸酶富集试剂盒等。判断标准也很直接：如果 90% 的 reads 来自宿主，那么你实际只买到十分之一的微生物数据。这个比例会直接改变预算，必须在方案阶段就摸清。
低生物量样本能做吗？
能做，但处理方式完全不同。核心风险是试剂污染——当样本里只有几百个细菌时，提取试剂和耗材带进来的 DNA 可能比样本自身信号还多。做法上必须每批都同步跑严格的空白对照（同一套试剂、同一套流程），必要时用低起始量优化的建库方案。采样前联系我们，而不是采样后。采样管、保存方式和运输条件会直接决定这个项目能不能用。
数据量大，普通电脑能分析吗？
大概率不行。几十个样本做标准深度组装，算力需求远超普通工作站，通常要在高性能计算集群或云上跑。流程编排建议用 Nextflow 或 Snakemake 固化，保证可复现。我们这边有现成的流水线，交付时一并给出版本与参数。
功能预测和宏基因组测到的"功能"有什么区别？
16S 的功能结果是从参考基因组推断出来的，微生物功能冗余度高，可靠性有限，文章里应该写成"预测"。宏基因组是直接测到了那段基因，可信度高一档。但要注意：测到基因代表"有这个潜力"，不代表"正在活跃表达"——要谈活性，需要宏转录组、宏蛋白组或代谢组来补。
样本需要多少重复？
生物学重复建议每组 ≥6 个，条件允许做到 10 个更稳；纵向采样优于单次横断面快照，可以避免个别异常样本主导结论。正式开题前用预实验数据做一次功效分析最保险。同时请记录并控制抗生素、饮食、取材时间等混杂因素。
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